随着基因包(panel)测序、临床/医学外显子组测序(clinical/medical exome sequencing)、全外显子组测序(whole exome sequencing)、全基因组测序(whole genome sequencing)等技术在临床的广泛应用，疾病的诊断、治疗和预后都得到了更为丰富、精准的提示和建议。

近年来，将外显子组测序(exome sequencing，ES)技术应用于产前诊断的尝试不断增多。虽然国外出台了相关指南、共识以及联合声明^[1,2,3,4]，但目前国际上对于这类技术在产前诊断应用中的许多方面，如检测方案、数据解读、检测结果的报告等尚处于摸索和循证阶段^[5,6,7,8]。由于胎儿表型信息严重匮乏，针对临床意义不确定(variantion of uncertain significant，VUS)的基因变异及与检测指征不相符的意外发现等，通常建议依照检测前咨询沟通所形成的协议进行报告^[2]。

目前国内对ES的产前诊断应用尚缺乏专家共识或指南，具体操作过程中如知情告知主要内容细节、数据分析流程、结果解读、报告撰写及遗传咨询等方面均亟需细化。鉴于此，国内多家已经开展胎儿外显子组测序检测的产前诊断机构或实验室参考了国内外最新的指南和专家共识后，针对ES在产前诊断中的应用细节展开了讨论，重点对产前外显子组测序的检测前咨询要点、数据分析流程、报告标准及内容和检测后咨询等提出了技术层面的建议，以达到规范ES在产前诊断中的应用的目的。

本规范适用于基于高通量测序技术以外显子组为主要检测目标的临床技术方案，涵盖各种规模的基因包测序、医学外显子组测序、全外显子组测序以及全基因组测序，不包含线粒体测序。除非特别说明，后文中涉及咨询和报告等对象的主体均为胎儿。

受检测技术和医学认知水平所限，目前ES在产前诊断中的应用仅限于对超声或磁共振成像发现的胎儿结构畸形进行相关的遗传病因学筛查。对有不良孕产史但本次妊娠未见胎儿畸形的情况、孕妇或家属希望排查遗传病以及缓减焦虑的情况，目前不推荐使用。咨询医师应熟悉每种检测方案和技术的优缺点和适用范围。全基因组测序目前一般不作为常规检测项目，仅适用于寻找内含子区深处的变异、倒位及平衡易位等特殊情况。

对于外单位的检测结果，应有应对和评估机制以及相关的标准化操作程序(standardized operating procedure，SOP)。咨询医师应明确告知本实验室ES的检测方法、检测范围、阳性率、各种可能的检测结果及后续的应对策略，同时应告知目前ES在胎儿遗传疾病查因上的局限性以及残余风险。

详尽的检测前告知及知情同意对于产前ES检测格外重要。建议产前ES知情同意书至少涵盖以下内容：(1)遗传病、基因组及基因等基本概念的介绍；(2)检测方法、检测目的及内容；(3)技术优势和局限性；(4)临床适应证；(5)检测方案及报告周期(建议4周以内)；(6)报告范围及可能出现的检测结果；(7)强烈建议胎儿及其父母同时检测，可能存在遗传/表型异质性、外显率和表现度的差异等特殊情况导致对预后判断的困难，以及可能存在检测失败的情况；(8)可能检测到肿瘤易感性变异、迟发性疾病相关变异、不符合孟德尔遗传规律的变异，并协商是否书面报告此类结果；(9)在不涉及受检者隐私及利益的前提下，样本和数据有可能被用于非商业目的的医学科研及论文发表；(10)临床医师、孕妇签字。

鉴于检测周期限制，产前ES的适宜时间段为孕12～33周。此范围外的胎儿目前不建议进行ES检测。

胎儿表型信息主要以超声等影像学检查结果作为依据。因此，对超声检查结果的收集极为重要。根据相关指南及专家共识，对于孕11～13^＋6周颈项透明层(nuchal translucency，NT)≥3.0 mm(>95%头臀径)^[9]或有一个或多个器官结构异常或重度宫内生长发育受限(<第10百分位)的胎儿，建议行ES产前检测。常见的胎儿超声结构异常包括但不限于：心血管畸形、中枢神经系统畸形、囊状水瘤/积液、颅面部/颈部畸形、腹壁缺损、消化道畸形、泌尿生殖系统畸形、肢体/指趾畸形、肺/胸/胸廓/膈畸形、内脏反转等。此外，对于重度羊水过多(羊水最大暗区>15 cm或羊水指数>45 cm)、羊水过少(羊水最大暗区≤2 cm或羊水指数≤5 cm)、双侧脑室增宽、脑积水等情况，也建议进行产前ES。对于超声软指标异常(包括鼻骨缺如或发育不良、肠管回声增强、轻度肾盂分离等)等情况，ES不作为首选推荐。可根据临床具体的沟通情况以及各实验室数据，交代残余风险后酌情建议^{[8,10,11,12,13,14]}。

强烈建议胎儿连同其父母同时进行ES检测(WGS除外)，以减少假阳性结果。在检测前应当就报告范围进行告知和协商。对于成年期肿瘤以及与胎儿表型无关的父母遗传病携带状态等意外发现是否需要报告进行约定。

建议申请单涵盖但不限于以下内容：(1)基本信息：申请单抬头、受检者姓名、性别、年龄、民族、唯一识别号(如诊疗卡号)、联系电话、申请科室、申请医师、申请日期、样本类型、临床初步诊断(若有)等；(2)病史信息：现病史、生育史、既往史、家族史、既往检测结果等；(3)胎儿超声或磁共振等影像学信息：应尽可能详细，胎儿影像学的详细检查报告应随申请单送到实验室。胎儿超声结构异常的具体情况，应写明测量值及其对应孕周及偏离正常范围的程度；(4)样本信息：绒毛、羊水、脐血、外周血等(注：流产组织属于产后样本，但也可以用于畸形胎儿引产后查因)；(5)检测内容：基因包、医学外显子组、全外显子组或全基因组测序。

强烈建议将胎儿与父母的样本同时送检。为避免细胞培养可能对不同类型的细胞产生偏好性选择的影响^[10,11]，原则上建议用未经培养的原始样本(血性羊水可酌情培养)直接检测。

判断产前样本是否合格的重要指标为提取的DNA纯度和浓度及有无母源DNA污染，同时可参考以下经验进行判断：(1)羊水样本：清亮，离心后细胞沉淀足量且无肉眼可见的血污染；(2)绒毛样本：显微镜下可见绒毛；(3)产前脐血样本：短串联重复(short tandem repeats，STR)或血红蛋白电泳证实样本为胎源性；(4)流产或死胎组织样本用于胎儿畸形查因时，建议尽早取材。所有行ES的产前诊断样本均建议进行STR分型，以排除母源DNA污染。

不合格的样本须退回或拒收，包括但不局限于以下情形：(1)严重腐败的样本，或用福尔马林浸泡的样本；(2)存在严重的母源污染且无法去除、非胎源性样本或提取的DNA质量不合格；(3)使用肝素抗凝等可能导致PCR扩增失败的样本(限包含PCR步骤的实验)。

不同的实验平台应建立相应的SOP，技术人员严格遵照执行。

在开展产前ES检测的临床服务前，需对数据分析过程、实验方案、试剂盒、仪器平台以及数据分析流程进行性能确认^[12,13]。在使用无国家药品监督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)医疗器械注册证的仪器和试剂开展检测时，推荐参考实验室自建检测项目(Laboratory Developed Test，LDT)^[14]进行管理。

参加国家卫健委临检中心组织的室间质评，以评估实验室的数据检测、分析和解读能力。

产前ES下机数据应进行两条独立的生物信息学管线分析，采用两套不同的开源软件、商业软件或自建算法进行含数据质控、过滤和注释等全流程的双人双线独立分析，结果核对后再汇总报告。采用的生信软件及分析流程必须经过临床应用前的性能确认，包括但不限于对已经过其他可靠方法(如Sanger测序)验证的变异位点检测的敏感性和特异性等指标的评价。评估生信管线的精密度、准确度等指标。

6.1　产前外显子组测序数据的质量控制　ES的数据分析质控指标很多。产前ES数据分析对于数据质量的要求应更高。在进行每一步分析或过滤前，应当对数据的关键质量指标进行评价，包括但不限于以下指标：Q30>85%，测序平台的相关测序错误率<7‰、有效数据量(不同的检测方案要求不同，全基因组测序单个样本的数据量应>90Gb)，覆盖情况(WES20×以上>95%)；覆盖均一度[500 kb以上的拷贝数变异(copy number variation，CNV)分析]；变异位点的测序深度(>30×)。

对于在临床使用的数据分析流程和相关数据质量的关键指标，需要有足够数量的阳性(>50例)和阴性样本进行校正和验证，需要为每个样本制定包含但不限于以上描述的数据质量关键指标来定义敏感度(sensitivity)和特异度(specificity)。对于有异常的数据质量关键指标，需要有明确的预警。

每个变异位点均需要经过遗传学(父母来源)或方法学(Sanger测序或其他方法)的验证。对于基因组内同源序列>95%的区域或基因，发现的变异仅能作为提示，报告前需要经其他方法进行验证。

6.2　变异分类原则按美国医学遗传学会/美国分子病理学会(American College f Medical Genetics/Association of Molecular Pathology，ACMG/AMP)、ClinGen等发布的国际标准对变异进行分类(致病、可能致病、临床意义不明、可能良性、良性)^[15,16,17]。对变异分类判断的主要依据包括SNV和CNV是否影响蛋白编码基因或重要调控元件的功能、受累基因或区域的剂量敏感性、文献报道、ClinVar、ClinGen、DECIPHER、OMIM、GeneReviews、UniProt等数据库、实验室内部数据库、普通人群频率(DGV/DGV-gold/gnomAD)数据库的收录情况、家系共分离情况、变异来源(新发或遗传自父母)等。

SNV和Indel的分类参照2015年ACMG/AMP变异位点判读指南及其中文版^[15,17]，并结合近年ClinGen等更新的补充建议和共识^[16,18,19]；基因内CNV的分类依据2019年ACMG/AMP的建议，不涉及转录本间差异和疾病～基因相关性等方面的建议^[20]；涉及多个基因的CNV及UPD等结构变异的分类参见相关团体标准^[21]。变异致病性证据链和良性证据链参见表1。各级证据的强弱程度根据已有研究及文献报道可能进行升、降级。本规范暂不引入证据的升降级体系，可自行参考文献进行实际操作。

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表1

变异致病性证据链和良性证据链

表1

变异致病性证据链和良性证据链

	证据链	证据链使用更新建议	基因内CNV证据链使用修改建议[20]
致病性	PVS1：当一个疾病的致病机制为功能丧失(LOF)时，无功能变异(无义变异、移码变异、经典±1或2的剪接变异、起始密码子变异、单个或多个外显子缺失)【注：(1)该基因的LOF是否是导致该疾病的明确致病机制(如GFAP、MYH7)；(2)3′端末端的功能缺失变异需谨慎解读；(3)需注意外显子选择性缺失是否影响到蛋白质的完整性；(4)考虑一个基因存在多种转录本的情况】	1.并非所有的移码均可以使用PVS1，鉴于该证据链对变异位点的分类具有重要影响，需慎重使用。2.建议遵照变异对蛋白功能影响程度执行标准[22]，遵照基因与疾病的关系(必须至少是"中等"相关以上，否则不可使用PVS1证据)。3.当PVS1用于经典剪接位点变异分类证据时，不再同时使用PM4和PP3；4.用软件预测LOF变异的不计入本证据链，归入PP3。5.已使用任意强度的PVS1时不能再同时使用PM4。	1.对于丧失功能致病基因的缺失CNV涉及所有编码外显子，使用PVS1_stand-alone可以单独判为"致病"；2．对于丧失功能致病基因的缺失CNV涉及蛋白重要功能域的多个(2个以上)外显子且导致功能严重异常的蛋白，建议使用PVS1；3．移码或涉及起始密码的缺失CNV(无可替代起始密码)建议使用PVS1；4．对于小于2个外显子的缺失，如果涉及整码或3′端的缺失CNV，在确定导致蛋白严重异常时建议使用PVS1，影响不确定时建议使用PM4；5．对于重复型CNV，如确定为串联重复，且已经明确导致蛋白严重异常，建议使用PVS1，影响未知时建议使用PM4，预测可能有严重影响的视具体情况使用PVS1或PM4；6．不能明确是否为串联重复的CNV视情况使用PVS1或PM4。7．PS1的使用可以扩展到有类似变异的CNV，涉及最后一个外显子的缺失，如果有已知类似截短的致病变异时可以用；已有小的致病整码缺失，CNV预测为整码缺失时可用。8．PM2/BA1/BS1的使用，可以参照DGV、gnomAD[30]和内部数据库。需要明确的是数据库的频率需要确认，而且各类疾病的阈值并不一致。9．当存在DNA转录本或蛋白水平上具有类似效应的致病变异时(如一个经典剪接预测相同外显子跳跃)使用PM5
	PS1：与先前已确定为致病性的变异有相同的氨基酸改变。例如：同一密码子，G>C或G>T改变均可导致缬氨酸→亮氨酸的改变。注意剪接影响的改变PS2：患者的新发变异，且无家族史(经双亲验证)。注：仅仅确认父母还不够，还需注意捐卵、代孕、胚胎移植的差错等情况PS3：体内、体外功能实验已明确会导致基因功能受损的变异【注：功能实验需要验证是有效的，且具有重复性与稳定性】PS4：变异出现在患病群体中的频率显著高于对照群体。【注：(1)可选择使用相对风险值或者OR值来评估，建议位点OR大于5.0且置信区间不包括1.0的可列入此项；(2)极罕见的变异在病例对照研究可能无统计学意义，原先在多个具有相同表型的患者中观察到该变异且在对照中未观察到可作为中等水平证据】	1."先前已知致病变异"需用本标准评级，经过评级确定其致病性，且对其评级时不使用PS1和PM5证据亦能达到致病级别；2.PS2与PM6互相排斥，只能取其一，该项与表型相关，表型越特异、越吻合，证据强度越高；3.新发变异的特殊情况：对新发的X连锁变异的未患病母亲，除了其儿子携带此变异且发病外，其家族内其他男性亲属不携带此变异且不患病，此时可用该证据；常染色体隐性遗传基因中一个新发变异，如果该基因中未找到其他已知的致病或可能致病的变异时，新发变异证据强度应下调；明显的生殖腺嵌合(如连续生育多个携带相同变异的患儿，父母检测变异为阴性)，可使用此证据，但需确定变异的父系或母系来源；4.mRNA分析证明变异影响剪接时使用PS3，不能同时使用PP3，其他情况可同时使用PS3和PP3。是否适合使用PS3建议依照ClinGen规范[23]5.PS4极少用到病例对照数据，一般用先证者例数来计算[19]对于常染色体隐性遗传病的变异，该条证据链改用PM3。
	PM1：位于热点变异区域，和/或位于已知无良性变异的关键功能域(如酶的活性位点) PM2：ESP数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库中正常对照人群中未发现的变异(或隐性遗传病中极低频位点)【注：高通量测序得到的插入/缺失人群数据质量较差】PM3：在隐性遗传病中，在反式位置上检测到致病变异【注：这种情况必须通过患者父母或后代验证】PM4：非重复区框内插入/缺失或终止密码子丧失导致的蛋白质长度变化PM5：新的错义变异导致氨基酸变化，此变异之前未曾报道，但是在同一位点，导致另外一种氨基酸的变异已经确认是致病性的，如：现在观察到的是Arg156Cys，而Arg156His是已知致病的，注意剪接影响的改变PM6：未经父母样本验证的新发变异	1.PM1仅用于错义变异及读码框内的Indel变异，对于截断变异和同义变异不可使用。建议引入本地统计数据，根据数据库给出"热点"的频率；得到公认的热点区域建议使用，如KCNQ4基因第271-292氨基酸[16]2.人群基因型频率应当有特定阈值，不同类型遗传病不尽相同，如常染色体显性和隐性耳聋和的阈值分别设置为0.002%和0.07%[16]，部分已经明确的高频致病位点应当列为实验室白名单；3.PM4不适用于移码变异、无义变异和剪接位点变异，已使用PVS1时不能再同时使用PM4；涉及翻译起始位点的应当用PVS1评估。
	PP1：变异与疾病在家系中共分离(在家系多个患者中检测到此变异)【注：如有更多的证据，可作为更强的证据】PP2：对某个基因来说，如果这个基因的错义变异是造成某种疾病的原因，并且这个基因中良性变异所占的比例很小，在这样的基因中所发现的新的错义变异PP3：多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物造成有害的影响，包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等【注：由于做预测时许多生物信息学算法使用相同或非常相似的输入，每个算法不应该算作一个独立的标准。PP3在一个任何变异的评估中只能使用一次】PP4：变异携带者的表型或家族史高度符合某种单基因遗传疾病PP5：有可靠信誉来源的报告认为该变异为致病的，但证据尚不足以支持进行实验室独立评估	1.符合PM2条件下使用PP1，要求至少在一个家系中看到有共分离现象，不同的基因或疾病对于共分离的个体或家系要求不同。具体使用请参见ClinGen给出的部分基因该条证据链的使用示例[24]2.PP2可查询gnomAD数据库中的基因错义变异Z-score(gene missense Z-score)，当Z-score≥3.09时可认为适用PP2证据[25]3.PP3用于临床产前需要格外小心，如确需用到建议使用综合多种算法的软件，目前建议参考对错义变异REVEL的评分，当评分>0.75时可使用PP3证据(听力损失的REVEL值≥0.7)[26]；4.表型一般不用于判断位点致病性，除非是相关疾病表型很特异，且遗传方式与变异吻合，且该基因很少见良性变异，可以用PP4；5.PP5已经弃用
良性	BA1：ESP数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库中等位基因频率>5%的变异	独立证据。需要扣除已经明确的高频致病位点(白名单)，至少观察2000个等位基因位点。对于少数变异虽然等位基因频率大于5%仍可能为致病变异，需特别注意(涉及的例外基因至少有ACAD9、GJB2、HFE、MEFV、PIBF1、ACAD5、BTD)[27]
	BS1：等位基因频率大于疾病发病率BS2：对于早期完全外显的疾病，在健康成年人中发现该变异(隐性遗传病发现纯合、显性遗传病发现杂合，或者X连锁半合子) BS3：在体内外实验中确认对蛋白质功能和剪接没有影响的变异BS4：在一个家系成员中缺乏共分离【注：这部分需要考虑复杂疾病和外显率下降、性别依赖性外显、拟表型等问题】	ClinGen变异解读工作组对不同疾病或基因的BS1应用频率有建议，如RASopathy，等位基因频率>0.025%；CDH1、PTEN等位基因频率>0.1%；注意BS2的应用条件，对不完全外显疾病不能应用此证据；对于剪接位点，BS3需要注意与软件结果的PP3冲突；BS1/BS2/BA1均涉及人群频率数据，不同疾病应当有不同的阈值，部分疾病的参考阈值建议参照已有研究数据设定[28,29]
	BP1：已知一个疾病的致病原因是由于某基因的截短变异，在此基因中所发现的错义变异BP2：在显性遗传病中又发现了另一条染色体上同一基因的一个已知致病变异(反式位置)，或者是任意遗传模式遗传病中又发现了同一条染色体上同一基因的一个已知致病变异(顺式位置) BP3：功能未知重复区域内的缺失/插入，同时未导致基因编码框改变BP4：多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物无影响，包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等【注：由于做预测时许多生物信息算法使用相同或非常相似的输入，每个算法不应该算作一个独立的标准。BP4在任何一个变异的评估中只能使用一次】BP5：在已经有另一分子致病原因的病例中发现的变异BP6：有可靠信誉来源的报告认为该变异为良性的，但证据尚不足以支持进行实验室独立评估。BP7：同义变异且预测不影响剪接	当某基因的致病变异全部或绝大部分(>90%)为截短变异时，该基因上发现的错义变异可用BP1；应用BP3时可通过UCSC网站RepeatMasker工具栏查询重复区域位置；BP5需要排除以下情况：常染色体隐性遗传病携带者、导致表型更严重的第二个变异、导致合并第二种遗传病、双基因遗传病和修饰基因；BP6已经弃用；BP7的使用需要慎重排除影响剪接

6.3　变异数据分析流程　在分析ES下机数据前，应检查完善运行环境和必备的数据库。以Illumina测序平台为例，应当在数据分析前具备完整的运行环境，如Linux操作系统、数据转换/拆分软件、参考基因组、基因组注释数据库、变异数据库等，各软件和数据库应当备注版本号和日期。

用ES数据分析SNV和Indel有较大的优势，对于CNV的检测和分析能力会因不同的检测方案而存在较大的差异，从小到数个基因的基因包到全外显子组，均是针对特定基因组区域的不连续检测。因此，在检测CNV时会面临信号不连续和断点不准确的问题。WGS能够较为全面地检测CNV。从下机数据到最后的变异列表的分析，具体的流程及判断标准参见图1及表1。

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图1

产前ES数据分析流程图

图1

产前ES数据分析流程图

产前ES报告的规范撰写，对于医师开展遗传咨询、孕妇及其家属对胎儿预后的估计、妊娠结局的选择及后续妊娠的管理等起着非常关键的作用。产前ES报告至少应涵盖以下要点：(1)完整的报告抬头；(2)基本信息：样本编号、受检者姓名、孕妇年龄、唯一识别号、送检科室、申请医师、送检样本类型、送检时间；(3)临床诊断：超声或磁共振等影像学信息，临床初步诊断；(4)家族史；(5)报告内容：按ISCN和HGVS命名体系报告SNV或CNV结果；(6)结果分析：应写明对检测到的SNV或CNV的致病性分析。变异相关的病例的主要临床表现、代表性参考文献；(7)报告结论：对检出的变异需明确其为致病、可能致病或意义不明，相关结论的证据链应当作为报告附件一并提供。需要强调的是，致病变异可能由于遗传异质性、外显不全或表现度差异，并不一定会在个体上表现出疾病表型，需在报告中明确这一点；(8)遗传咨询意见：针对检测结果，给出后续的建议，如出生预后、治疗方案、疾病管理、再发风险或进一步的检测手段等；应结合检测方案报告检测后的残余风险；(9)具有产前诊断分子遗传资质的实验室技师、具有产前诊断资质的副高级以上的遗传咨询医师签名、报告日期。产前ES报告应当至少有3名技术人员签字审核，含2名副高级职称以上，其中1人为临床医师；(10)附录与声明：应列出产前ES的检测范围、使用的平台、检测技术的局限性、对部分不报告结果的说明等。

产前ES的报告均应当经过检验人员、生信分析人员、医学遗传学专业技术人员以及母胎医学专业医师的审核。对于复杂疑难病例，应建立长效会诊机制，由相关专业的技术人员共同讨论，讨论的组织者应当有权限获取胎儿及其家族的所有病史资料。

建议实验室建立并定期更新内部和外部数据库，定期对阴性病例、可能致病和临床意义不明的变异进行回顾分析。鼓励实验室之间在保护就诊者隐私前提下共享数据。

参与本规范起草和修订的专家名单：

张彦(广东省妇幼保健院)；刘维强(广州医科大学附属第三医院)；章钧(中山大学附属第三医院)；林少宾(中山大学附属第一医院)；黄辉(深圳华大基因股份有限公司)；张巍(嘉检医学)；任志林(北京贝瑞和康生物技术有限公司)；王游声(广东省妇幼保健院)；杨亚平(美国贝勒医学院)；黎青、陈敏(广州医科大学附属第三医院)；郭辉(深圳市人民医院)；谢建生(深圳市妇幼保健院)；魏凤香(深圳市龙岗区妇幼保健院)；张静(深圳市南山区妇幼保健院)；刘彦慧、何怡(东莞市妇幼保健院)；陈剑虹(惠州市第一妇幼保健院)；王德刚(中山市博爱医院)；唐佳(江门市妇幼保健院)；李萍(广东省人民医院)；范舒舒(粤北人民医院)；谭卫荷(清远市人民医院)；何志晖(广州医科大学附属第一医院)；闫瑞玲、查庆兵(暨南大学附属第一医院)；江凌晓、杨芳(南方医科大学附属珠江医院)；丁红珂、刘畅、刘玲、齐一鸣、黄演林、张琪、曾玉坤、刘渊、余丽华、王兴旺、李发科、尹爱华(广东省妇幼保健院)