遗传病是基因或基因组的结构或功能改变所导致的疾病。据世界卫生组织统计，已知的人类疾病中有10 000多种为单基因遗传病[1]，包括目前在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)已收录的6550种单基因遗传病[2]。基因检测对于了解遗传病的发生机制，早期诊断、早期干预、遗传咨询和指导生育等均具有重要的意义[3]。基因测序是目前广泛应用的一种检测技术。诞生于1977年的Sanger测序技术发展至今已有40多年历史。与Sanger测序相比，二代测序技术(next generation sequencing，NGS)因其简单、快速、高分辨率、高通量等特点，得到了越来越多的应用，成为临床检测领域的一项革命性技术，被广泛应用于遗传病、实体瘤、血液病和传染病等的检测[4]。
近年来，国内外二代测序市场竞争的参与者不断出现，不少公司均开展了基于二代测序的临床检测服务，如筛查染色体非整倍体的无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)、肿瘤的个体化治疗等。相关行业规范和法规的出台，直接促进了NIPT检测市场的有序发展和繁荣。遗传病的产前诊断及筛查、单基因和多基因遗传病的检测和咨询等也在成为一个重要的应用方向[5]，因此也亟需一套覆盖实验室检测标准和管理规范的行业规范共识，指导将二代测序技术用于遗传病的临床诊断或筛查实验室，以提供稳定、可靠、有效的检测数据，用于临床辅助诊断或筛查工作。本共识旨在为从事遗传病二代测序检测的实验室建立从样本采集到产生二代测序数据的全流程规范化管理提供指导。
遗传病二代测序临床检测实验室必须建立严格的管理制度、标准化操作程序、系列质量管理文件等，以确保实验室的长期稳定运行、卫生安全、以及检测结果的准确性。
遗传病二代测序临床检测实验室的总体设置与运行标准应符合《临床机构实验室管理规范》(卫委发[2006]73号)的要求；设计标准、工作基本原则以及注意事项应符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》(卫办医政发[2010]10号)及其附件《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的要求。实验室安全工作制度或安全标准操作程序应符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。原则上，临床二代测序实验室应设置以下区域：样本接收与存储区、试剂存储与准备区域、样本制备区、文库制备区、扩增及测序区。这5个区域在空间上必须完全相互独立，拥有严格的工作区空气及人员流向，以有效防止样本核酸提取及建库扩增等过程所发生的污染[6,7,8]。临床样本处理及制备区应符合生物安全二级实验室对于防护设备、个人防护和操作规范的要求。即使是普通的病理组织或血液样本，也可能存在病原体(如HIV、HBV、HCV等)，存在导致操作人员被感染的风险。
遗传病二代测序临床检测人员应具备分子生物学、临床医学等相关专业大专以上学历，并经过二代测序技术理论与技能培训且达到合格及以上水平，实验室负责人或技术负责人应有全面的二代测序知识，人员能力和数量应满足开展检测的要求。
遗传病二代测序临床检测实验室应该做好仪器设备维护及保养，建立仪器设备标签管理、档案管理，按设备要求定期进行计量校准及维护管理。
二代测序检测的实验技术步骤包括患者样本的采集与运输、样本接收与存储，核酸提取，添加个性化分子标签，文库构建(包括核酸样本均一化、片段化、外显子组或特定区域靶向富集、接头连接、扩增、文库均一化)和上机测序，如图1所示。
鉴于临床样本的特殊性和珍贵性，对不同的样本应采取不同的要求和标准来采集包含基因组DNA的生物样本，包括但不限于全血、唾液、干血片、组织和已提取的DNA等。在样本采集前，应向受检者或其监护人介绍检测知情同意书的条款，指导其签署知情同意书。之后帮助或指导受检者或其监护人填写检测申请单，核对申请单与受检者的基本信息是否一致，检查受检者是否按照医嘱准备，并向其解释操作的目的以取得配合(见第一部分)。
采集样本时，应在采集管上贴上医院样本的唯一条码，并标明受检者姓名、年龄、检测项目等信息，确保与检测申请单一致。如果无法贴上医院条码，则需确认采血管上的受检者信息清楚，且与检测申请单上的信息一致。采集完的样本应与签字的知情同意书及检测申请单一并寄送至委托的检测机构，并扫描相关资料以备存档。
鉴于送达实验室的标本在采集、转运和贮存中发生的差错将造成检测结果的错误，可能导致临床的误诊和无效治疗。为保证检验结果的准确性及可靠性，对于不同类型的样本，实验室必须有不同的样本采集和转运规范参考[9,10,11]，具体可参考表1。在物流环节须有相应的运送记录，以确保生物样本的完整性、无破损、无污染。
遗传病二代测序临床检测样本的采集、运输与存储参考
遗传病二代测序临床检测样本的采集、运输与存储参考
| 样本类型 | 静脉血/脐血 | DNA | 流产物/组织 | 干血片 | 唾液或口腔拭子 |
|---|---|---|---|---|---|
| 采集 | 采集0.5～2 mL静脉血或脐带血至EDTA抗凝管中，轻轻上下颠倒采血管8～10次，混匀 | 取500 ng左右抽提的DNA于EB管中，体积不少于20 μL，浓度不小于25 ng/μL。gDNA片段主带应大于23 kb | 取5～10 mg脐带、皮肤或其他新鲜组织样本，置于液氮中0.5 h或放置于细胞保存液中 | 将全血滴加在专用滤纸片上，干燥后得到2～4个直径超过8 mm的干血斑 | 采集唾液或使用口腔拭子(2个)收集口腔黏膜细胞，放置于含保存液的试管中 |
| 采集后至送样前保存条件 | 4℃冷藏，3天内寄送，3天以上建议－20℃保存 | 4℃冷藏，3天内寄送，3天以上建议－20℃保存 | －20℃，有细胞保存液者1周内寄送。无细胞保存液者建议24 h内寄出 | 常温密封保存 | 常温 |
| 运输时限在途时间 | 36 h | 36 h | 24～36 h | 5天 | 7天 |
| 运输条件 | 常温(4℃冷藏样本)；干冰运输(－20℃保存样本) | 常温(4℃冷藏样本)；干冰运输(－20℃保存样本) | 冰袋运输(有保存液)，干冰运输(无保存液) | 常温 | 常温 |
| 实验室存储条件 | 4℃冷藏，3天内完成抽提，3天以上或抽提后剩余的样本保存于－80℃ | 4℃冷藏，3天内完成质检及相关检测取样，3天以上或实验后剩余样本存储于－80℃ | －80℃存储 | 4℃冷藏，3天内完成抽提，3天以上或抽提后剩余的样本存储于－80℃ | 常温 |
对于运送至实验室的样本，需要有接收与拒收标准，并给予恰当的处理。针对客户要求样本返还的情况，应该制定相应的流程来实施返还。
检测实验室的样本接收人员负责检查样本量、样本类型是否符合检测要求，并核查随样本寄送的检测申请单信息是否完整，并核对其与电子版本的一致性。若发现信息填写不清楚或不完整，需通过特定的沟通途径与申请人联系并更新信息。若接收无误，则应由相应人员用邮件告知申请人样本的录入情况。与此同时，样本接收人员需将样本以临床信息通过双人核查的形式录入到电子存档文件或系统中。建议一对一生成检测实验室内部编号，用于后续的实验流转，以保护受检者的隐私信息。
用于基因检测的样本应由医院长期保存(建议至少保存2年)。检测机构应依据不同的样本类型，选择合适的物流条件，将样本整理寄送回医院。长期保存条件参考表1。对于医院不要求返还处理的样本，检测机构可在送检知情同意书中约定样本保存的年限，超过年限时可按事先约定的方式进行处置[12]。
作为实验室二代测序检测流程的第一步，抽提得到的核酸的质量将直接影响后续文库构建实验的成败及测序数据的质量。检测实验室需根据不同的原始样本类型(包括但不限于血液、唾液、干血片、组织及其他体液样本等)建立相应的核酸抽提操作的规范流程，同时需要制定核酸样本的质量评估标准，进行核酸定量分析，包括浓度、体积及总量；以及核酸定性分析，包括DNA纯度和完整性判断。此外，还应根据后续的二代测序实验检测需要，制定明确的接收和拒绝标准。
对于常规的二代测序检测，核酸抽提环节的质量控制需要考虑：DNA的A260/A280值应在1.6～2.2之间，琼脂糖凝胶电泳结果DNA主带明显，无明显降解，无明显的蛋白质、多糖和RNA污染，这些是DNA定性分析结论最基本的要求。
一般情况下，核酸抽提获得的DNA会超过后续建库实验所需，因此建议分装出工作液用于后续的检测，剩余部分的DNA，若客户短期内没有返还样本的需求，建议检测机构对其妥善保管。DNA可短期保存在4℃(4周)或－20℃(1年)，长期保存于－80℃(7年)，且反复冻融不超过3次[13]。
样本在实验室内部的转运，建议保证标签的一致性和可溯源性，采取可识别的编号，同时反映样本的不同状态，如原始样本、抽提出的DNA样本、DNA建库中间产物、DNA建库终产物等。样本的正确转运对于二代测序实验结果的准确性和可靠性至关重要，建议实验室制定相应的标准操作规范(standard operation procedure，SOP)。同时对于实验室内部转运过程，应做好纸质或电子交接记录，保证整个过程有据可查、有据可依。
文库构建是整个二代测序进程中极为重要的一环，其质量的好坏将直接影响后续的测序数据质量。二代测序技术尽管发展迅速，但基因文库的构建仍是一项十分耗时且复杂的工作，需要熟练的技术人员在整个操作过程中保持高度的注意力。因此，针对上述问题，制定和区分不同检测策略所使用的实验流程文件，做好全流程的质控，并使用对照样本，对于文库构建实验的稳定和可靠性尤其重要。目前市场上有商业化的文库构建试剂盒，同时也有部分检测机构用自制的试剂构建文库。无论使用哪种试剂用于临床基因检测，首先都应该有一套可靠的实验方法来评估其有效性，且需要经过一段时间的试用期来复验。在评估与复验的过程中，需要参考临床允许的误差范围，建议将方法验证的数据结果与标准样的数据结果进行比较，量化数据参数的精密性、准确性、灵敏性与特异性和可报告范围等考量指标。同时需要综合考虑仪器设备与试剂的稳定性进行判定。通过方法学的验证，该检测实验方可转化为标准化实验室操作流程规范。在验证后，操作流程规范若发生任何变动，包括试剂、仪器、检测项目等，都需要重新进行验证。性能验证方案、检测过程和结果应保存相应的记录。
文库构建过程的质控包括：(1)按已验证的检测流程实施文库的构建。首先应探索出有效且满足建库需求的最低起始建库DNA输入值，即检测限度。运用液相杂交捕获的方法，建议的样本起始量为200 ng；对于扩增子捕获实验，则建议以10 ng为起始量；(2)建议在建库过程中同时设置空白阴性对照并使用标准品作为阳性对照。标准品可以选用商品化的细胞系标准样本或检测实验室已验证过的样本，用于监测实验室日常检测的可重复性和再现性，以及当批次临床样本检测的有效性；(3)对构建好的文库进行质控时，需要根据不同项目的要求来监控文库的浓度或总量、产物片段的长度及分布、阴性及阳性对照的文库质检情况，并制定接受或拒绝的标准，以判定批次建库的成功与否。文库质控的具体标准需根据检测策略的不同制定出特异性的标准，不能一概而论。此外，建议将文库构建实验的中间产物保存1个月。
测序仪是基因测序的重要工具，目前市场上的二代测序仪主要包括Illumina、Thermo Fisher及华大智造等厂商提供的具有不同通量、读长及研究适配的测序仪器。测序时应根据检测的样本量和质量要求，确定适宜的测序平台与方案，以保证临床遗传病的二代测序数据能够满足数据质量及靶向区域覆盖度等需求。实验室应具备满足测序仪的正常运行所必需的实验室洁净度、温/湿度、防震和光照等条件。测序质量的参考值为：测序数据的单碱基质量评估指数(Q30)≥ 70%，同时文库复杂度的指示值重复读数百分比(duplication reads rate)也需要控制在一定的范围内，目标区域的平均深度应根据检测策略对基因变异判定所需的数据深度的需求而定。
因涉及仪器损耗与试剂批次间的差异，建议在二代测序过程中以固定的时间间隔或在更换试剂批次时，加入标准品文库的测序与数据质量评估，对测序试剂与仪器的稳定性进行评估。二代测序的下机原始数据(BCL文件)建议保存0.5～1个月。Fastq文件格式的数据保存的考量应包括原始数据的可溯源性、现有技术(包括测序技术、遗传变异位点处理技术)的版本可溯源性、基于目前知识注释解读的可溯源性及患者在一定时限内对数据的索取权，保存的时间和方式可视不同检测机构的情况而定，建议至少保存5年。同时，基于数据安全的考虑，应考虑实施必要的防火墙、加密和管理。
遗传病的二代测序临床检测涉及临床样本的实验操作，实验的结果将被直接用于指导临床。为确保在检测过程中样本无混淆或污染，建议检测机构设置样本追踪流程。在上传数据前，对数据与原始样本做强制性一致性分析，通过后方可上传数据用于后续的生物信息及遗传信息分析。样本追踪流程包括两个方面，性别一致性鉴定与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)一致性鉴定。性别一致性方面，可将客户在临床信息中提供的性别信息与数据的性别分析得出的结果进行对比。如果结果不一致，则建议联系送检单位或个人来确定性别信息，同时检测机构应积累性染色体多倍性经验用于处理样本为非正常性染色体倍性相关的情况。SNP一致性鉴定方面，建议选用多个SNP位点或其他标签作为样本的身份标识。首先通过设计的引物做DNA样本的SNP位点检测，待二代测序检测后对该样本数据中上述位点的SNP情况进行追踪比对，证明DNA样本与其产生的数据中SNP位点的一致性[13]。针对样本数据的污染问题，同时建议在生物信息分析阶段对数据的低频突变频率(low call variant ratio)进行监控。该指标若异常升高，也能够提示数据存在污染。针对上述追踪流程中异常结果的报告，检测实验室应在第一时间对失误进行原因分析，并及时采取应对措施或备选方案。
遗传病二代测序临床实验室应当对检测中可能存在不确定性或产生偏差与错误的环节进行有计划的监督和内部质量控制。通常情况下，每次检测应至少添加一个阳性质控、一个阴性质控或空白对照与常规样本同时检测，并设定质控标准，保留质控记录。
同时，应该有计划地采用留样复测、相同样本相同人员不同时间重复实验、相同样本不同人员相同时间重复实验、不同方法相同样本的比对、设备定期核查等方式定期对检测系统的稳定性、仪器设备、人员等环节进行内部质控。
此外，开展遗传病二代测序临床实验室应每年或每两年参加由卫健委或美国病理学家协会(College of American Pathologists，CAP)组织的基因检测能力评估考核。作为室间质量评价的参考，如结果不合格，应当分析原因，并采取相应的预防或纠正措施。
本共识讨论涵盖了将二代测序技术应用于遗传病基因检测的整个流程。目前国内已有许多二代测序公司试水临床遗传病的检测，而对于涉及临床检测的实验室操作尚无统一的标准。部分公司仍在沿用科研的标准来进行临床检测实验。在实验室医学时代，70%以上的信息均来自实验室。没有精准检测，何来精准医疗？因此，实验室的标准化非常重要[14]。在临床实验室进行的规范化与标准化的检测与质控，有助于使遗传学专家或医师得到精确可靠、准确有效的检测数据进行分析，生成具有临床指导意义的遗传检测报告，进行准确的诊断并实施正确的治疗干预和产前诊断等。尽管国际上发布了一些二代测序的指南和指导意见[15,16,17]，我国也出台了相关的诊疗规范、共识[6,7,8]，很多实验室也在遵从ISO 15189质量管理体系标准对实验室进行质量管理，但这些指南和意见往往并未涉及技术的具体操作以及如何做好质量控制的细节内容。即使是严格按照相关国际指南或行业标准建立起来的实验室或技术平台，在实际进行样本检测和结果分析时也会出现诸多不吻合或明显存在矛盾的结果。在我国，二代测序临床实验室的质量管理仍有很多细节有待于完善。本共识将为同行业的检测者提供参考，但更多的细节还需要相关的实验室通过不断的沟通与交流，确定普遍适用且有效的共识与标准。同时，实验室也应同临床医师与遗传分析人员保持互动，沟通内容包括从实验室获得检测技术策略选择的建议、检测技术性价比的评估、检测方案的适用性评价等，共同为遗传病二代测序实验室建立完善的检测共识，为提高遗传诊断检测的水平贡献力量。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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